使用western blot检测磷酸化蛋白形式，有两个关键环节需要注意。蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。因为在蛋白裂解时，会破坏溶酶体结构，诱发大量的蛋白酶释放进入裂解后的上清中，这些蛋白酶可能会对一些蛋白进行降解，由此需要加入蛋白酶抑制剂;不仅如此，蛋白的磷酸化一般由蛋白激酶和磷酸酶相互作用而产生。由于蛋白裂解后，部分磷酸酶的活性可能诱发蛋白进一步出现磷酸化修饰，由此需要加入磷酸化酶抑制剂干预上述过程。不仅如此，不同的磷酸化蛋白检测也是稍有不同，例如ERK通路有色氨酸位点和苏氨酸位点磷酸化，所以最好加入对应位点氨基酸的磷酸化酶抑制剂。

　　很多cocktail中包含有上述成分，因此需要在实验进行前，确认cocktail中的抑制剂是否包含中所需要的成分。最后，在某些特殊情况下，特别是pH依赖的蛋白或是细胞模型，需要考虑加入碱性或酸性磷酸酶抑制剂，这样是为了保证裂解过程中的溶酶体酸性环境，不会破坏所建立的细胞模型，从而减少误差。

　　上述磷酸化蛋白的检测要点，你都get到了么。

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